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T7 RNA聚合酶(T7 RNAP)活性定量檢測試劑盒介紹
檢測原理：
T7 RNAP活性是T7表達系統(tǒng)的重要參數(shù)，其活性大小直接影響到T7表達系統(tǒng)對外源基因的轉(zhuǎn)錄(mRNA制備)和表達(重組蛋白的制備)的效果。對于T7 RNAP活性的檢測，尤其是在混合液(制備mRNA的反應液、細胞破碎液等)中的T7RNAP活性原位檢測由于干擾因素過多，很難實現(xiàn)T7 RNAP的定量檢測。本試劑盒是利用了T7表達系統(tǒng)的特異性，在特殊的體系中將T7RNAP活性含量與表達的綠色熒光蛋白量關(guān)聯(lián)起來，通過檢測熒光響應值定量計算出T7 RNAP活性。檢測原理流程如下[1]：
適用體系：
試劑盒所用反應試劑是經(jīng)過幾十種成分優(yōu)化并添加了獨特的抗干擾試劑制備而成，對樣品中存在的其它物質(zhì)有很好的抗干擾能力。所以與以往檢測T7 RNAP活性的方法不同，本試劑盒不但可以測定純化的T7RNAP樣品，還可以直接測定混合物中含有T7 RNAP的樣品，其中包括：
① 測定純化的T7RNAP溶液中T7 RNAP活性含量
② 測定用T7轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)制備mRNA過程中反應液中的T7 RNAP活性含量
③ 測定表達了T7 RNAP菌體樣品中的T7 RNAP活性含量
應用場合：
l 本試劑盒可以用于制備T7 RNAP過程中，純化的T7 RNAP試劑樣品的質(zhì)量監(jiān)測
l 為T7表達系統(tǒng)表達外源蛋白過程的分析提供T7 RNAP活性含量定量數(shù)據(jù)
l 指導T7獨立表達系統(tǒng)的理性構(gòu)建
l T7表達系統(tǒng)為基礎(chǔ)的無細胞催化研究中反應條件的優(yōu)化及反應過程分析
l T7 RNAP基因突變以及分子定向進化對T7 RNAP活性的影響研究
l mRNA制備過程的工藝優(yōu)化及生產(chǎn)質(zhì)量監(jiān)控
l mRNA疫苗制備和生產(chǎn)過程工藝條件優(yōu)化和質(zhì)量控制等
T7 RNA聚合酶(T7 RNAP)活性定量檢測試劑盒使用說明
檢測原理：
T7 RNAP活性是T7表達系統(tǒng)的重要參數(shù)，其活性大小直接影響到T7表達系統(tǒng)對外源基因的轉(zhuǎn)錄(mRNA制備)和表達(重組蛋白的制備)的效果。對于T7 RNAP活性的檢測，尤其是在混合液(制備mRNA的反應液、細胞破碎液等)中的T7RNAP活性原位檢測由于干擾因素過多，很難實現(xiàn)T7 RNAP的定量檢測。本試劑盒是利用了T7表達系統(tǒng)的特異性，在特殊的體系中將T7RNAP活性含量與表達的綠色熒光蛋白量關(guān)聯(lián)起來，通過檢測熒光響應值定量計算出T7 RNAP活性。檢測原理流程如下[1]：
適用體系：
試劑盒所用反應試劑是經(jīng)過幾十種成分優(yōu)化并添加了獨特的抗干擾試劑制備而成，對樣品中存在的其它物質(zhì)有很好的抗干擾能力。所以與以往檢測T7 RNAP活性的方法不同，本試劑盒不但可以測定純化的T7RNAP樣品，還可以直接測定混合物中含有T7 RNAP的樣品，其中包括：
④ 測定純化的T7RNAP溶液中T7 RNAP活性含量
⑤ 測定用T7轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)制備mRNA過程中反應液中的T7 RNAP活性含量
⑥ 測定表達了T7 RNAP菌體樣品中的T7 RNAP活性含量
應用場合：
l 本試劑盒可以用于制備T7 RNAP過程中，純化的T7 RNAP試劑樣品的質(zhì)量監(jiān)測
l 為T7表達系統(tǒng)表達外源蛋白過程的分析提供T7 RNAP活性含量定量數(shù)據(jù)
l 指導T7獨立表達系統(tǒng)的理性構(gòu)建
l T7表達系統(tǒng)為基礎(chǔ)的無細胞催化研究中反應條件的優(yōu)化及反應過程分析
l T7 RNAP基因突變以及分子定向進化對T7 RNAP活性的影響研究
l mRNA制備過程的工藝優(yōu)化及生產(chǎn)質(zhì)量監(jiān)控
l mRNA疫苗制備和生產(chǎn)過程工藝條件優(yōu)化和質(zhì)量控制等。
試劑盒組成：
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試劑盒組成
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保存條件
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A101-1
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A101-2
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A101-3
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規(guī)格
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20次
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50次
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100次
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試劑A
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-20℃以下
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約155µL
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約390µL
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780µL
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試劑B
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-20℃以下
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約132µL
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約330µL
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約660µL
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試劑C
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-20℃
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約50µL
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約125µL
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約250µL
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T7 RNAP標準品(10U/µL)
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-20℃以下
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30µL
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70µL
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135µL
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注：測定次數(shù)是指：包括用于標準曲線法標準樣品的測定、比例法標準樣品的測定和待測樣品的測定所用試劑次數(shù)總和。
試劑盒配套的T7 RNAP標準品是按照檢測次數(shù)十分之一的量提供。
本試劑盒所用T7RNAP聚合酶標準品溶液是經(jīng)過特殊處理的，專門為本試劑盒配套使用的，市售的T7 RNAP無法在本試劑盒中定量使用。
檢測步驟
1） 試劑盒中的試劑盡量避免反復凍融，以免喪失活性。第一次使用時，將試劑盒中的全部試劑分別在冰水浴中融化，根據(jù)用戶自己每次測定樣品的個數(shù)分裝成合適體積，按照試劑盒的保存條件冷凍保存。
2） 取出分裝好的試劑A、B、C和T7 RNAP標準品，置于冰浴中融化，分別取7µL試劑A，6µL試劑B和2µL試劑C加入到同一個經(jīng)過冰浴冷卻的1.5mL的塑料離心管中，并保持離心管一直在冰浴環(huán)境，根據(jù)樣品中T7 RNAP活性含量，向上述離心管中加入1-5µL待測樣品(待測樣品需要將T7 RNAP活性含量稀釋一定的倍數(shù)至檢測活性范圍內(nèi))，不足5µL的部分用無菌去離子水補足到5µL。
3） 將上述加入了總共20µL溶液的1.5mL離心管混勻，并在4℃，1000rpm下離心1分鐘，然后放入34℃水浴搖床上反應60min。待反應時間結(jié)束時，快速加入980µL冰冷的經(jīng)過滅菌的去離子水混勻，得到熒光待測液，并放置在冰水浴中。
4） 為了定量計算T7 RNAP活性，在測定樣品時，需要同時按照1）~3）的步驟做一個加入T7 RNAP標準品的樣品檢測。
5） 分別取200µL步驟3）中的熒光待測液(包括步驟4)的標準品熒光待測液)至黑色Costar 96孔板，用熒光酶標儀在激發(fā)波長460nm，發(fā)射波長510nm，增益值為100情況下測定熒光值。與步驟4）標準品樣品的熒光值進行比較，按比例計算出樣品T7 RNAP活性值。
6） 建議：為了保證測定數(shù)據(jù)的穩(wěn)定性，建議一次測定多個樣品，同時進行一個T7 RNAP標準品的檢測作為參比值，先計算所需要試劑的總體積，然后將試劑A、B和C混合，分別取15µL加入到1.5mL塑料離心管中，再按照實驗的需要加1-5µL待測樣品。
參考文獻：
[1] Mingxin Cui, Okei Wong, Qiang Li, Wenya Wang, An Assay Method for Characterizing Bacteriophage T7 RNA Polymerase Activity by Transcription–Translation (TX-TL) System, The Journal of Biochemistry, 2023;, mvad002, https://doi.org/10.1093/jb/mvad002
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